В 386 году святой Иоанн был хиротонисан епископом Антиохийским Флавианом во пресвитера. На него возложили обязанность проповедовать Слово Божие. Святой Иоанн оказался блестящим проповедником, и за редкий дар Богодохновенного слова получил от паствы наименование "Златоуст". Двенадцать лет святой, при стечении толп народа, обычно дважды в неделю, а иногда - каждодневно, проповедовал в храме, глубоко потрясая сердца слушателей.
В пастырской ревности о наилучшем усвоении христианами Священного Писания святой Иоанн обращается к священной герменевтике - науке о толковании Слова Божия. Среди его экзегетических творений - толкования на целые книги Священного Писания (Бытия, Псалтирь, Евангелия от Матфея и Иоанна, Послания апостола Павла) и множество бесед на отдельные тексты святой Библии, а также поучения на праздники, в похвалу святых и слова апологетические (против аномеев, иудействующих и язычников). Иоанн-пресвитер ревностно исполнял заповедь попечения о бедных: при нем Антиохийская Церковь питала каждый день до 3000 дев и вдовиц, не считая заключенных, странников и больных.
В начале Великого поста 388 года святитель начал толкование книги Бытия. За Четыредесятницу он произнес 32 беседы. На Страстной седмице говорил о предателе и о Кресте, на Пасхальной седмице и до Пятидесятницы ежедневно прихожане наставлялись его пастырским словом. Толкование книги Бытия было закончено в конце октября.
С Пасхи следующего года святой начал изъяснение Евангелия от Иоанна, а в конце 389 года перешел к Евангелию от Матфея. В 391 году антиохийские христиане слушали его толкование на Послания святого апостола Павла к Римлянам и к Коринфянам. С 393 года он обратился к Посланиям к Галатам, Ефесянам, Тимофею, Титу и псалмам. В беседе на Послание к Ефесянам святой Иоанн обличал антиохийский раскол: "Говорю и свидетельствую, что раздирать Церковь не менее значит, как и впадать в ересь. Церковь есть дом Отца Небесного, Единое Тело и Единый Дух".

Росла слава святого проповедника, и в 397 году, по преставлении Константинопольского архиепископа Нектария, преемника святителя Григория Богослова, он был вызван из Антиохии для поставления на Константинопольскую кафедру. В столице святой архипастырь не мог проповедовать так часто, как в Антиохии. Множество дел ожидало решения святителя, он начал с главного - с духовного совершенствования священства. И здесь лучшим примером был он сам. Средства, которые предназначались для архиепископа, святой обратил на содержание нескольких больниц и двух гостиниц для паломников. Архипастырь довольствовался скудной пищей, отказывался от приглашений на обеды. Ревность святителя к утверждению христианской веры распространялась не только на жителей Константинополя, но и на Фракию, включая славян и готов, Малую Азию и Понтийскую область. Им был поставлен епископ для Церкви Боспора, находившейся в Крыму. В Финикию, Персию, к скифам для обращения ко Христу язычников святой Иоанн направлял ревностных миссионеров, писал послания в Сирию, чтобы вернуть Церкви маркионитов, и добился этого. Храня единство Церкви, святой не позволил могущественному готскому военачальнику, диктовавшему свои условия императору, открыть в Константинополе арианский храм. Много трудов положил святитель на устроение благолепного Богослужения: составил чин Литургии, ввел антифонное пение за всенощным бдением, написал несколько молитв чина елеосвящения. Распущенность столичных нравов, особенно императорского двора, нашла в лице святителя нелицеприятного обличителя. Когда императрица Евдоксия распорядилась о конфискации последней собственности у вдовы и детей опального вельможи, святой встал на их защиту. Гордая императрица не уступила и затаила гнев на архипастыря. Ненависть Евдоксии к святителю разгорелась с новой силой, когда недоброжелатели сказали ей, будто святитель в своем поучении о суетных женщинах имел в виду ее. Суд, составленный из иерархов, справедливо обличаемых ранее Златоустом: Феофила Александрийского, Севериана, Гевальского епископа, незадолго перед тем изгнанного из столицы за беспорядки, и других - постановил низложить святого Иоанна и за оскорбление императрицы предать казни. Император заменил казнь изгнанием. У храма толпился возбужденный народ, решивший защищать своего пастыря. Святитель, чтобы избежать волнений, сам отдал себя в руки властей. Той же ночью в Константинополе произошло землетрясение. Дворец содрогнулся. Испуганная Евдоксия просила императора срочно вернуть святого и немедля послала письмо изгнанному пастырю, умоляя его вернуться. И вновь в столичном храме святитель в краткой речи благословляет Господа "за все пути Его". Клеветники бежали в Александрию. Но уже через два месяца новый донос пробуждает гнев Евдоксии. В марте 404 года состоялся неправедный Собор, постановивший изгнать святого Иоанна. По удалении его из столицы, пожар обратил в пепел храм Святой Софии и здание сената. Вскоре последовали опустошительные набеги варваров, а в октябре 404 года умерла Евдоксия. Даже язычники видели в этих событиях небесное наказание за неправедное осуждение угодника Божия.
Находясь в Армении, святитель еще более старался укрепить своих духовных чад. В многочисленных письмах (их сохранилось 245) епископам Азии, Африки, Европы и особенно своим друзьям в Константинополе святой Иоанн утешал страдающих, наставлял и поддерживал своих приверженцев. Зимой 406 года святитель Иоанн был болезнью прикован к постели. Но враги его не унимались. Из столицы пришел приказ перевести святого Иоанна в глухой Питиус (в Абхазии). Истощенный болезнями святитель в сопровождении конвоя три месяца в дождь и зной совершал свой последний переход. В Команах силы оставили его. У склепа святого Василиска (память 22 мая), утешенный явлением мученика ("Не унывай, брат Иоанн! Завтра мы будем вместе"), причастившись Святых Тайн, вселенский святитель со словами "Слава Богу за всё!" отошел к Господу 14 сентября 407 года. Святые мощи Иоанна Златоуста торжественно были перенесены в Константинополь в 438 году. Ученик святого Иоанна, преподобный Исидор Пелусиотский (память 4 февраля), писал: "Дом Давидов укрепляется, а дом Саулов слабеет, как ты видишь: он победил бурю жизни и переселился в Небесный покой".